以下文章來(lái)源于質(zhì)譜成像先鋒隊(duì)
1 前言
瓦博格效應(yīng)（Warburg effect）被認(rèn)為是腫瘤代謝的一大特征，其內(nèi)在機(jī)制十分復(fù)雜，雖近年來(lái)的研究提出并證實(shí)了相應(yīng)的一些調(diào)控機(jī)制，但依然還有很多疑問(wèn)亟待解決，因此，研究瓦博格效應(yīng)中關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)有助于揭示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為腫瘤的靶向性治療提供很好的方向和策略。目前，腫瘤細(xì)胞中如何通過(guò)三羧酸（TCA）循環(huán)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸鹽仍不明確，雖然磁共振波譜（MRS，Magnetic Resonance Spectroscopy）和正電子發(fā)射斷層掃描（PET，Positron Emission Topography）等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤代謝通路的研究，但在通量上仍有一定的局限性。本文以MALDI質(zhì)譜成像為主要分析技術(shù)，結(jié)合13C穩(wěn)定同位素示蹤法，直接呈現(xiàn)出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中13C6-葡萄糖的TCA代謝物的空間分布，有效地揭示了膠質(zhì)瘤組織中TCA循環(huán)活性的下調(diào)特征。
2 實(shí)驗(yàn)方法
取病人來(lái)源的異種移植（PDX）的小鼠分別在0min和30min通過(guò)腹腔引入13C6-葡萄糖，在60min后宰殺小鼠并獲取器官，制備小鼠腦膠質(zhì)瘤組織的冷凍切片。將膠質(zhì)瘤切片轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電載玻片上，使用HTX M3+自動(dòng)化基質(zhì)噴涂?jī)x噴涂N-(1-萘)乙二胺鹽酸鹽（NEDC）基質(zhì)。通過(guò)timsTOF fleX MALDI-2、在負(fù)模式下進(jìn)行20μm空間分辨率的MALDI成像實(shí)驗(yàn)，使用SCiLS? Lab 2023a進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，并在MetaboScape® 2023a進(jìn)行分子注釋。在SCiLS REST API通過(guò)R語(yǔ)言提取母離子和所有碳同位素的強(qiáng)度信息。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
圖2. A) 空白組和給藥組切片的光學(xué)圖片，其中深色區(qū)域?yàn)槟[瘤；B) 空間聚類分析劃分的腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域；C) 蘋果酸鹽[M+0]峰的離子熱圖；D) 蘋果酸鹽[M+1]峰的離子熱圖；E)主成分分析得分圖。
MALDI成像常常產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)，需要借助專業(yè)的軟件才能實(shí)現(xiàn)有效的數(shù)據(jù)挖掘。布魯克推出的SCiLS Lab軟件，集數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)可視化為一身。首先，SCiLS Lab對(duì)空白組和給藥組的鼠腦膠質(zhì)瘤組織的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行空間聚類分析，將組織根據(jù)分子組成的差異性進(jìn)行區(qū)域劃分。如圖2B所示，空白組切片可以劃分為橙色和綠色兩個(gè)區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)腫瘤區(qū)域和健康組織區(qū)域，而在給藥組切片中，劃分的藍(lán)色和黃色區(qū)域分別是健康組織區(qū)域和腫瘤區(qū)域。在此基礎(chǔ)之上，通過(guò)SCiLS Lab的“空間共定位”功能，可以進(jìn)一步篩選出在腫瘤區(qū)域具有高表達(dá)的分子。圖2C和2D為蘋果酸的M+0和M+1峰的離子熱圖，蘋果酸在空白組和給藥組的腫瘤切片中均具有顯著表達(dá)。由于健康組織和腫瘤組織具有不同的分子表型，因此基于MALDI成像得到的分子圖譜可以快速地識(shí)別出空白組和給藥組中腫瘤區(qū)域。
圖3. 空白組和給藥組中腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域差異性分析得到的ROC曲線
通過(guò)SCiLS Lab中的ROC分析、T檢驗(yàn)可以快速篩選并驗(yàn)證腫瘤組織和健康組織的差異性分子。圖3為ROC分析找到的差異性分子，AUC值越高，差異越明顯。以檸檬酸（m/z 191.0195）、谷氨酸鹽（m/z 146.0469）等為例，作為TCA循環(huán)中的重要代謝產(chǎn)物，它們均可以有效地區(qū)分空白組和給藥組中的腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域。
圖4. TCA循環(huán)中代謝物的離子熱圖
此外，SCiLS Lab還提供了API擴(kuò)展功能接口，可以方便用戶進(jìn)行更靈活的數(shù)據(jù)處理。在本文中，通過(guò)R語(yǔ)言將所有母離子以及碳同位素的強(qiáng)度信息提取出來(lái)，從而對(duì)腫瘤組織中TCA循環(huán)中代謝物進(jìn)行定量分析。圖4為TCA循環(huán)中典型代謝物的離子熱圖，參與循環(huán)的蘋果酸等在腫瘤區(qū)域的空間表達(dá)顯著高于健康組織區(qū)域。圖5為在13C6-葡萄糖攝入后，乳酸和蘋果酸對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物M+0、M+1、M+2、M+3和M+4的同位素相對(duì)強(qiáng)度比值；與健康組織相比，腫瘤組織中M+0的比例更高，而M+2、M+3和M+4的比例較低。結(jié)合上面兩部分?jǐn)?shù)據(jù)，說(shuō)明膠質(zhì)瘤組織較健康區(qū)域TCA循環(huán)的活性發(fā)生顯著下調(diào)。
4 結(jié)論
本文展示了基于布魯克timsTOF fleX MALDI-2質(zhì)譜儀的空間代謝流分析流程。timsTOF fleX MALDI-2質(zhì)譜儀可以實(shí)現(xiàn)高空間分辨率的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)采集，配套的SCiLS Lab軟件具有多元化統(tǒng)計(jì)分析功能和API擴(kuò)展接口功能，可以對(duì)MALDI成像數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的分子信息挖掘。與傳統(tǒng)組學(xué)流程相比，MALDI成像獨(dú)特的“定位功能”優(yōu)勢(shì)能夠獲取動(dòng)態(tài)條件下某一代謝通路在組織某個(gè)部位的含量變化，為理解腫瘤代謝過(guò)程提供了直觀、全面的動(dòng)態(tài)分析視角，將對(duì)腫瘤的空間代謝研究工作起到極大的推動(dòng)作用。