圖文來(lái)源于 布魯克納米表征表面儀器 郭鑫博士
“內(nèi)容介紹
MicroRNAs (miRNAs)在控制各種細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在癌癥等病理?xiàng)l件下，個(gè)體miRNA的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生顯著變化。如果能在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確、定量的檢測(cè)miRNA將有助于更好的理解miRNA的功能。雖然Northern印跡、PCR、納米孔傳感器和單分子熒光顯微鏡等方法都可以定量分析miRNA。但是由于濃度、靈敏度、可重復(fù)性等問(wèn)題，這些方法仍有其局限性。韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)的Joo Won Park等人報(bào)道了一種使用原子力顯微鏡直接檢測(cè)miRNA的方法。（J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 36, 11664–11671）1通過(guò)掃描微米大小的DNA斑點(diǎn)，原子力顯微鏡可以量化單個(gè)神經(jīng)元中的miR-134 RNA數(shù)量；可以在去膜后的固定神經(jīng)元細(xì)胞上觀察到單個(gè)miR-134 RNA分子。
圖1 上半部分：為了定量化檢測(cè)特定miRNA，從單個(gè)細(xì)胞中提取總RNA，并使目標(biāo)miRNA與探針DNA點(diǎn)雜交；下半部分：在固定的單個(gè)細(xì)胞上繪制特定miRNA的原位分布，并使探針DNA與固定的miRNA雜交。利用連接HBD的原子力顯微鏡探針產(chǎn)生的力-距離力曲線中的特定粘附力來(lái)識(shí)別miRNA/DNA雜交物。單個(gè)的miRNA/DNA雜交物在粘附力圖上呈現(xiàn)為一簇像素。實(shí)驗(yàn)方法
作者將N末端的人RNase H1蛋白通過(guò)表面修飾的方法固定在原子力顯微鏡針尖上。這種蛋白可以結(jié)合RNA/DNA雜交雙鏈，稱(chēng)為雜交結(jié)合域（hybrid binding domain, HBD），在這里作者使用結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的DNA探針而不是RNA來(lái)檢測(cè)mRNA。在實(shí)驗(yàn)中，修飾后的探針用于檢測(cè)一種腦特異性miRNA，miR-134。這是一種能夠調(diào)節(jié)脊椎生長(zhǎng)和樹(shù)突生成的腦特異性miRNA。
為了驗(yàn)證特異性的識(shí)別，作者首先將全部RNA從細(xì)胞中提取出來(lái)，并將其與固定在玻璃片上面積大約15-20平方微米的探針DNA斑點(diǎn)雜交。使用布魯克ForceRobot原子力顯微鏡2進(jìn)行單分子力曲線測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘附力大約在20pN上下，解離距離大約3.8nm。通過(guò)對(duì)比修飾后探針與單鏈ssDNA，雙鏈dsDNA和雙鏈dsRNA斑點(diǎn)以及經(jīng)過(guò)RNase H處理后的斑點(diǎn)間的力曲線，可以確認(rèn)這是一種特異性結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)AFM掃描像素點(diǎn)尺寸在4nm時(shí)，miR134的粘附力圖為一個(gè)由34個(gè)像素點(diǎn)組成的團(tuán)簇，并且在大多數(shù)像素點(diǎn)上觀察到特異性結(jié)合的概率不低于40%。這一團(tuán)簇可以被擬合為一個(gè)橢圓，等效圓半徑14nm。這一尺寸與結(jié)合構(gòu)型中的分子尺寸一致。通過(guò)是否產(chǎn)生粘附力團(tuán)簇、特異性結(jié)合產(chǎn)生的概率即可判斷原子力顯微鏡探針是否檢測(cè)到了目標(biāo)mRNA分子。
圖2 對(duì)miR-134進(jìn)行選擇性識(shí)別。miR-134和pre-miR-134分別與單個(gè)的探針DNA點(diǎn)雜交。在識(shí)別miR-134的探針DNA斑點(diǎn)時(shí)，觀察到了在粘附力圖像中的聚集現(xiàn)象。相比之下，在識(shí)別pre-miR-134的探針DNA斑點(diǎn)上沒(méi)有觀察到聚集的粘附力。在粘附力力圖中，每個(gè)像素上觀察到特異性結(jié)合概率以灰度顯示（30 × 30像素，240 × 240 nm2）。根據(jù)估計(jì)，單個(gè)miRNA種類(lèi)在細(xì)胞中的平均拷貝數(shù)約為500。為了確保能在單個(gè)細(xì)胞中識(shí)別目標(biāo)miRNA，作者使用FluidFM探針3制備了直徑為3-8 μ m的探針DNA斑點(diǎn)，通過(guò)將合成miR-134溶液（10-100 aM，40 μL中含有240-2400個(gè)拷貝）孵育在其中一個(gè)斑點(diǎn)上來(lái)評(píng)估識(shí)別效率。作者在每一個(gè)樣品的每一個(gè)斑點(diǎn)中的三個(gè)任意位置記錄粘附力數(shù)據(jù)并取平均值，計(jì)算了每個(gè)斑點(diǎn)上識(shí)別到的miR-134數(shù)目。通過(guò)線性回歸，作者計(jì)算出DNA斑點(diǎn)上miR-134的識(shí)別效率為78%。
圖3 DNA斑點(diǎn)上的miR-134。（a）在方格圖案化的玻璃片上生成的探針DNA（在3'端修飾Cy3）斑點(diǎn)的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺，10 μm。（b）在單獨(dú)的DNA斑點(diǎn)上檢測(cè)10-100 aM（240-2400個(gè)拷貝）的miR-134（30 × 30像素，300 × 300 nm^2）。觀察到特異性miR-134力曲線數(shù)量與樣品溶液中miR-134的初始數(shù)量之間呈線性相關(guān)，并且從線性回歸的斜率計(jì)算出捕獲效率為78%。（一個(gè)實(shí)心圓表示兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)重疊。）
在驗(yàn)證了這一方法可以成功識(shí)別體外RNA后，作者進(jìn)一步將這一方法應(yīng)用于單個(gè)海馬體神經(jīng)細(xì)胞上。使用進(jìn)行修飾后可以與miR-134互補(bǔ)的原子力顯微鏡探針，作者在神經(jīng)元體的隨機(jī)位置進(jìn)行了力曲線測(cè)試。作者使用布魯克NanoWizard原子力顯微鏡4對(duì)MAP2免疫染色標(biāo)記的神經(jīng)元在AC模式下進(jìn)行成像，并選擇了三個(gè)位置進(jìn)行粘附力測(cè)試（100×100像素，1.0×1.0 μm2），在同一位置得到細(xì)胞熒光圖像、原子力顯微鏡圖像與力曲線數(shù)據(jù)（圖4）。在神經(jīng)元體上，每個(gè)圖像中可以觀察到2-4個(gè)團(tuán)簇。RNase H處理后同一區(qū)域中團(tuán)簇的消失，這同樣證實(shí)了觀察到的粘附力曲線是具有特異性的。在固定的神經(jīng)元上，只有當(dāng)探針DNA與目標(biāo)RNA雜交時(shí)才觀察到合格的簇，而當(dāng)互補(bǔ)RNA或亂序DNA雜交時(shí)則不會(huì)觀察到團(tuán)簇，這與在玻璃片上DNA探針斑點(diǎn)上獲得的結(jié)果一致，即這一miRNA/DNA雜交是特異性檢測(cè)。
圖4 在固定的神經(jīng)元上繪制miR-134分布。（a）海馬神經(jīng)元（DIV7），MAP2；綠色。（b）a中的方框區(qū)域進(jìn)行原子力顯微鏡成像。（c）b中編號(hào)的區(qū)域在與miR-134互補(bǔ)DNA雜交后進(jìn)行粘附力實(shí)驗(yàn)。（d）相同的區(qū)域在用相同的探針進(jìn)行RNase H處理后重新測(cè)試，未觀察到團(tuán)簇。（c, d）黃色像素表示在五次測(cè)量中觀察到特定粘附力超過(guò)一次的位置（100 × 100像素，1.0 × 1.0 μm2）。a中的比例尺為50 μm，b中的比例尺為20 μm。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種方法的準(zhǔn)確性與特異性，作者還分析了在固定的神經(jīng)元上膜去極化誘導(dǎo)的miR-134表達(dá)變化。在固定前，海馬神經(jīng)元（DIV7）通過(guò)KCl（40 mM）處理2小時(shí)以誘導(dǎo)去極化。在受刺激的神經(jīng)元（1.0×1.0 μm2）的區(qū)域內(nèi)平均觀察到了9.9個(gè)團(tuán)簇，而在未受刺激的對(duì)照神經(jīng)元中僅檢測(cè)到了2.7個(gè)簇（見(jiàn)圖5）。使用共聚焦顯微鏡觀察c-Fos的表達(dá)增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了KCl刺激神經(jīng)元的效果。雖然需要進(jìn)一步研究了解AFM探針的壓入深度和樣品制備的影響，但這種直接的AFM粘附力圖像觀察到的簇?cái)?shù)增加與在DNA探針斑點(diǎn)上通過(guò)提取出RNA進(jìn)行宏觀評(píng)估的結(jié)果一致。同一細(xì)胞上不同位置和同一條見(jiàn)下不同細(xì)胞間miR-134數(shù)量變化很小，證明了其在DIV7海馬體神經(jīng)元內(nèi)是全局性表達(dá)的。
作者通過(guò)建立了一種基于原子力顯微鏡的粘附力成像新型miRNA定量方法。這種方法的靈敏度足以在單個(gè)細(xì)胞中分析特定miRNA的拷貝數(shù)，而無(wú)需修飾、逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增。同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)miRNA的原位測(cè)試。結(jié)合AFM的高分辨率特性，這種方法同樣適用于神經(jīng)元的其他區(qū)域，如樹(shù)突和突觸。如果借助快速原子力顯微鏡，將能夠高效地可視化單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)表面。此外，使用固定細(xì)胞和組織的切片能夠檢查細(xì)胞的內(nèi)部和特定的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。這種新的分析方法為理解miRNA的生物學(xué)作用及其細(xì)胞間變異提供了新的途徑。在生物樣品中檢測(cè)少量的miRNA生物標(biāo)志物將使得這種方法能夠作為一種可行的癌癥診斷工具。
圖5 神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)膜去極化誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)miR-134。（a）未受刺激的海馬體DIV7細(xì)胞與在固定前經(jīng)過(guò)40 mM KCl 2小時(shí)刺激的細(xì)胞。二者均經(jīng)過(guò)MAP2免疫染色。（b）原子力顯微鏡圖像。a比例尺50 μm，b比例尺20 μm。（c）在神經(jīng)元體上隨機(jī)位置測(cè)試得到的粘附力圖像。測(cè)試位置在b中用藍(lán)色箭頭標(biāo)注。（100 × 100像素，1.0 × 1.0 μm2）特異性粘附力產(chǎn)生概率超過(guò)20%的區(qū)域用黃色標(biāo)注，團(tuán)簇用紅色圓圈標(biāo)注。（d）在三個(gè)神經(jīng)細(xì)胞上分別進(jìn)行了三個(gè)不同位置的miR-134團(tuán)簇檢測(cè)。1.Visualization and Quanti?cation of MicroRNA in a Single Cell Using Atomic Force Microscopy
(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27529574)
在這篇文章中，作者使用了三種布魯克生物型原子力顯微鏡或附件：
2.布魯克ForceRobot® 400生物型AFM結(jié)合了許多獨(dú)特的力譜創(chuàng)新技術(shù)以在單分子水平上測(cè)量力。它能夠量化單個(gè)分子鍵的機(jī)械強(qiáng)度，并對(duì)分子相互作用和生物分子復(fù)合物的力依賴(lài)特性進(jìn)行表征。
（https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-forcerobot.html）
3.FluidFM中空探針配件可以輕易的與布魯克生物型原子力顯微鏡結(jié)合，可以輕松的處理微量液體。
（https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/bioafm/bioafm-accessories/fluidfm-add-on-from-cytosurge.html）
4.NanoWizard® 4 XP生物型原子力顯微鏡可置于倒置光學(xué)顯微鏡上，對(duì)從單分子到活細(xì)胞和組織的樣品進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，具有優(yōu)異的機(jī)械和熱穩(wěn)定性。
（https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-4-xp-bioscience.html）
